尽管冷冻干燥技术最初是为生物制品开发的，早在 1935 年的出版物中就有相关描述，然而，针对冷冻干燥组织所面临的诸多挑战，相关著述却相当匮乏。

冷冻干燥设备的设计和方法主要基于对诸如小瓶或托盘等容器中的液体配方进行处理。将液体物料在搁板上冷冻，然后通过升华和脱附将水分含量降低到足以维持长期稳定性的水平这一概念已为人熟知。

组织冻干之所以具有独特的挑战性，主要在于其材料的复杂成分、多样形态以及处理和储存容器的差异性。要为组织开发出一致且优化的冻干工艺，就需要全面考虑应用、设备以及冻干的三个步骤之间的关系。

冷冻

冷冻是冷冻干燥过程的基础。要实现高效且有效的冷冻干燥过程，就需要一种可靠的冷冻方法。

在冷冻干燥过程中，组织可置于袋、托盘、培养皿、试管或其他容器中进行处理。可放置在冷冻干燥机搁板上的容器可通过以受控速率降低搁板温度来进行受控冷冻。有些产品通过浸入液氮中冷冻，这会导致形成小晶体结构，因此建议在将材料放入冷冻干燥机后考虑进行退火步骤。

在某些特定情境下，人们会选择将组织样本置于 -80℃ 的冰箱中进行冷冻保存，以备后续处理之需。在低温冰箱中冷冻时，为确保整批样本冷冻效果的一致性，组织样本需以统一方式妥善安置于冰箱内。因此，应避免将样本堆叠放置，样本之间应留有空隙，以利于空气对流。放入冰箱时，冰箱内的温度应始终相同，采用搁板分隔袋或托盘，确保冷冻条件一致，进而实现所有样本冷冻过程的标准化。

最终的冷冻温度需低于 -40 摄氏度，考虑到组织的玻璃化转变温度，应为 -60 至 -80 摄氏度。博尔戈诺尼指出，牛心包膜的玻璃化转变温度低于 -80 摄氏度，临界温度为 -11.6 摄氏度，因此应在 -20 摄氏度左右进行 1 至 3 小时的退火处理。

重要提示：若腔室压力降低前组织样本未充分冻结，未冻结溶剂可能引发气泡，进而破坏产品结构。

冷冻的方法和速率会产生截然不同的冰晶结构。例如，快速冷冻（>10℃/分钟）会形成小冰晶结构，这可能会阻碍在一次干燥阶段的升华过程，而缓慢冷冻（1℃/分钟或更慢）则会形成大冰晶结构，有利于升华。对于某些产品，初始冷冻速率需要较快，以保持 pH 值、消除产品沉淀或防止细胞因冰晶缓慢生长而受损。在这种情况下，会增加一个退火步骤，使晶体尺寸增大，从而使升华蒸汽更容易从冷冻结构中逸出。正如博尔戈诺尼所述，采用缓慢冷冻或缓慢冷冻结合退火处理的方式，可以最大程度地降低冻干产品中的残留水分含量。

关于冷冻速率和方法对组织影响的研究将有助于更好地了解如何进一步改进冷冻技术。

摘要：

冷冻是冻干的基础。

冷冻过程应当保持一致且可重复。

所有产品都应以相同的方式放入冷冻室，以确保冷冻效果一致。

严格的过程控制与验证机制是确保冷冻干燥工艺成功实施并保持长期稳定的关键所在。

快速冷冻会形成细小的冰晶，这进而会导致一次干燥过程的速度减慢。

然而，对于组织而言，可能需要快速冷冻以消除细胞损伤。

在低于产品玻璃化转变温度的条件下冷冻

添加退火处理以改善晶体结构和一致性

- 一次干燥 - 升华干燥

升华是固态水在低压条件下直接变为水蒸气，而不会形成液态的过程。该过程是吸热的，这意味着升华中的物质会从周围环境中吸收热量，所以必须向物质中添加热量来推动升华过程。在冷冻干燥中，升华被用来去除冷冻材料中的水分。向产品中添加热量，将冰冻的水分变成水蒸气，然后水蒸气在冷凝表面上凝结，从而实现水分持续从产品中流出。

在一次干燥过程中，冷冻干燥机产品室内的压力会降低到远低于水的三相点 4600 毫托，以实现升华。对于大多数冷冻干燥应用，所使用的真空室压力水平在 50 毫托至 400 毫托之间。选择真空室压力需要在高效传热和保持产品低温之间取得平衡。通常，较低的真空室压力会因传热减少而导致升华速率降低，但也能使产品保持在较低的温度。需要确定一个最佳的真空室压力，以实现向产品良好传热，同时仍使产品温度保持在其临界温度以下，临界温度是指材料功效受损的温度。

升华从冷冻结构的表面开始，随着冰的去除和干燥层的形成而向内部推进。在初次干燥阶段，由于产品尚未干燥，物料表面几乎不对升华过程产生阻力，因此可以顺利推进该过程。然而，随着干燥层厚度的增加，升华产生的蒸汽难以找到从产品中逸出的路径，导致升华界面的压力增大和产品温度升高。保持搁板温度和压力在保护产品的水平上是很重要的。

在西林瓶冷冻干燥过程中，容器与温度可控的搁板之间有良好的接触。搁板温度升高以增加能量，从而提高升华速率。西林瓶与搁板的接触有助于实现良好的工艺控制。

用于处理组织的容器种类繁多。许多容器可能与搁板接触不良或根本不接触。托盘和盘子放置于搁板上，能够确保良好的接触，进而便于实现精确的过程控制。然而，试管和袋子可能与搁板不接触，此时主要的热传递方式就从传导变为对流和辐射。如果对此认识不足，可能会导致产品一致性问题。

在处理袋装组织时，不可能让所有袋子/材料都接触架子。为保持一致性，需要采用一种摆放袋子的方法。这种摆放方法应使袋子相互隔开且不接触架子，因为它们不可能全部接触架子。建议采用架子等手段隔离袋子，并设计摆放方式，确保组织与袋子接触，优化热传递效果。通过提供一种统一的摆放方法，产品的质量一致性将得到最大程度的保证。

确定合适的搁板温度和腔室压力对于优化工艺至关重要。为此，必须了解组织的临界温度。在一次干燥的整个过程中，工艺应尽可能将产品温度保持在临界温度以下几度的安全温度，以实现高效且稳健的循环。

常见误解在于，搁板温度曲线在循环初设较低，后阶梯式升高。这种阶梯式升温曲线效率极低，而且可能对产品造成损害。由于在一次干燥循环的开始阶段产品升华速率最高，因此搁板温度可以在循环开始时就升至最高温度。在整个循环过程中，可以使用能将产品温度保持在临界点以下的搁板温度。一次干燥循环结束时，升华过程完成，此时产品温度会升至最高点。建议使用恒定的搁板温度贯穿整个循环，以简化操作流程。博尔戈诺尼（2）描述了一个简单的搁板温度为 -5℃、腔室压力为 160 毫托的一次干燥循环。

当升华过程完成时，一次干燥结束，这可以通过电容真空计和皮拉尼真空计之间的压差测量来确定。皮拉尼测量会受到水蒸气存在的影响。在升华结束时，产品腔室内的水蒸气含量已降至最低水平，因此皮拉尼读数将非常接近电容真空计的读数，与干燥且空的腔室中的压差相同。一次干燥结束时，物料的含水量在 3% 至 5% 之间。若要达到更低的含水量，可增加二次干燥步骤。

- 初干阶段注意事项

升华是一个吸热过程，在升华过程中产物的温度会降低。

在一次干燥的初始阶段，升华速率最高，因为此时产品内部的蒸汽逸出没有阻力。

如前所述，在一次干燥过程中逐步升温并非理想选择。因此，建议在循环初期就将搁板温度调整至最佳状态。

- 二次干燥——解析干燥

对于药品及其他液态基质产品而言，二次干燥可去除物料中的结合水，从而进一步将水分含量降低至 0.5%。此过程采用更高的搁板温度，通过脱附作用促使结合水进入气态。

组织的残余水分目标值为 5% 或更低，这可能在一次干燥过程中实现。如果应用无法达到这些水平，则可能需要二次干燥步骤。文献中描述的二次干燥步骤是在 25℃ 的搁板温度和相同的真空室压力（即 160 毫托）下进行。二次干燥的持续时间通常在一次干燥时间的30%到50%之间。

其他值得注意的信息

后处理 - 交联

在加工基于胶原蛋白的材料时，可采用交联工艺来提高产品的机械稳定性。交联可在较高的搁板温度下进行，例如 105 摄氏度。

散装物料

在托盘中处理浆料时，由于产品表面积更大且与搁板接触更充分，因此在一次干燥过程中会产生更高的蒸汽负荷。对于这些应用，确保冷冻干燥设备能够处理整个周期内的蒸汽负荷至关重要。要确认冷凝器温度和产品室压力水平在整个周期内都能保持稳定。

托盘内料浆的厚度对一次干燥周期时间有着重要影响。物料越厚，一次干燥所需的时间就越长。这是由几何原理决定的。例如，1 英寸厚的物料与 0.5 英寸厚的物料相比，干燥时间可能会长 4 倍。

袋子

袋内的蒸汽压会高于腔室压力。蒸汽压越高，产品温度就越高。

您需要在一次干燥过程中确定并控制产品温度。

设备

冷冻干燥机冷凝器设计

采用“冷壁”式冷凝器（即无外露盘管）设计的设备，其冷凝器温度是在冷凝器入口处测量的，而非在冷凝表面测量。因此，冷凝器壁温可能已悄然升高至 -40℃ 以上，而操作人员对此却毫无察觉。冷凝器温度高于 -40℃ 会对冷冻干燥过程产生不利影响。

真空控制

早期的冷冻干燥机使用皮拉尼真空计进行工艺控制。我们发现，使用皮拉尼真空计控制真空度会导致循环过程出现波动。随着冷冻干燥机内的水蒸气减少，皮拉尼真空计读数降低，结果是干燥室内的压力升高。绝对真空度可能会升高多达 100 毫托。

建议工艺控制中采用电容式真空计，而将皮拉尼真空计仅作为判断一次干燥终点的一个参考指标。

请注意，将真空计从皮拉尼真空计更换为电容真空计（CM）需要仔细考虑。必须了解绝对压力。建议在转移循环之前，先用 CM 运行每个循环，以观察腔室的绝对压力。

21CFR 第 11 部分合规性

该行业在不断发展，可能需要符合美国食品药品监督管理局（FDA）的指导方针。在制药加工市场，FDA 要求控制系统能够符合 21CFR 第 11 部分的规定。这意味着需要一个安全的数据库、电子签名、变更日志以及用户级别控制。因此，建议采用 PC/PLC 控制系统。

参考文献

[01]- 强和麦肯齐 1993 年所著《组织冻干》《肌肉骨骼组织库》第五章，雷文出版社

[02]- 冻结速率对牛心包组织冷冻干燥的影响，博尔戈诺尼，2009 年，《巴西生物学与技术档案》

[03]- 生物样本的冷冻干燥和匀浆处理可提高分子生物学技术的重现性并降低标准偏差，Molnar，2021 年，施普林格·自然出版集团